DSHB抗体制备的工作准备
2025-10-21 13
以下是关于DSHB抗体制备工作的准备工作详细说明：
一、抗原处理与优化
1.抗原纯化
从细胞裂解物或培养上清中提取目标蛋白，采用亲和层析、离子交换等技术去除杂蛋白及其他杂质，确保抗原的高特异性。若使用重组表达系统（如大肠杆菌或哺乳动物细胞），需通过SDS-PAGE及Western blot验证目的蛋白的正确折叠与活性。
对小分子多肽类抗原可进行化学偶联载体蛋白（如KLH），增强免疫原性；大分子蛋白则直接作为免疫原使用。
2.定量与分装
使用BCA法或Bradford法测定抗原浓度，根据实验需求调整至适宜的工作浓度（通常为1mg/mL左右）。将纯化后的抗原分装保存于-80℃冰箱，避免反复冻融导致降解。
二、DSHB抗体实验动物选择与预处理
1.动物品系筛选
根据抗体类型需求选择合适的实验动物（常用BALB/c小鼠），优先选用6-8周龄的健康个体，确保其免疫系统活跃且无既往感染史。同一批次实验应保持动物遗传背景一致以减少个体差异影响。
2.免疫前适应期管理
新购入的动物需在SPF级环境中适应至少一周，提供无菌饲料和酸化水，监测体重增长曲线确认健康状态。此阶段可进行预采血作为后续阴性对照样本。
三、试剂与耗材准备
1.关键试剂配置
配制弗氏*全佐剂（FCA）与不*全佐剂（FIA）：按油相∶水相=3:1比例混合液体石蜡与司盘80，高压灭菌后4℃保存；使用时取等体积抗原溶液乳化形成乳浊液。另备PBS缓冲液、麻醉剂、止血棉球及75%乙醇消毒液。
2.专用器具灭菌
注射器、离心管、酶标板等接触生物样本的工具经高压蒸汽灭菌锅处理（121℃，20min），烘干后置于超净工作台备用。手术器械额外用紫外线照射30分钟强化消毒效果。
四、DSHB抗体免疫方案设计
1.初次免疫实施要点
采用多点皮下注射法，选取颈部、背部及腹股沟区域共注射5-6个位点，每个位点注入约50μg抗原乳化剂混合物。注射后轻柔按摩局部组织促进吸收，并做好标记便于追踪免疫反应进程。
2.加强免疫周期规划
间隔两周进行第二次基础免疫，后续每两周追加一次不含佐剂的纯抗原注射。定期采集尾静脉血样，利用ELISA初步检测血清效价动态变化，当滴度达到1:10^4以上时进入融合阶段准备。
五、细胞融合前期准备
1.骨髓瘤细胞复苏培养
从液氮罐取出SP2/0细胞株迅速转入37℃水浴震荡解冻，离心洗涤后接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中扩增培养。每日观察细胞形态与增殖速度，待密度达80%汇合时用于杂交瘤制备。
2.脾细胞悬液制备流程
末次免疫3天后脱颈处死小鼠，无菌条件下剖取脾脏剪碎成匀浆状，经200目不锈钢网筛过滤获得单细胞悬液。离心洗涤去除红细胞后计数活细胞数，调整至合适密度供后续融合使用。
六、DSHB抗体检测体系建立
1.包被抗原板制备
用碳酸盐缓冲液稀释纯化抗原至最佳包被浓度（通过方阵滴定试验确定），每孔加入100μL于96孔酶标板中4℃过夜孵育。次日洗板封闭非特异性结合位点，干燥密封备用。
2.阳性对照设置规范
设立已知阳性血清作为质量控制标准，同时包含空白对照、无关抗体对照以排除交叉反应干扰。所有样本均做梯度稀释后平行测定三次取平均值确保结果可靠性。
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