以下是 Transgenomics(IDT) 突变检测试剂盒的正确操作规程-创亚化工（上海）有限公司

2025-09-22 79

　　以下是 Transgenomics(IDT) 突变检测试剂盒的正确操作规程：

　　1.前期准备

　　-样本采集与处理

　　根据实验需求选择合适的样本类型，如血液、组织等。按照说明书要求对样本进行预处理，包括裂解细胞、提取核酸等步骤，以获得高质量的 DNA 用于后续实验。确保提取过程中避免引入杂质和抑制剂，以免影响后续反应的准确性。

　　-仪器校准与检查

　　确保所使用的仪器设备处于正常工作状态。提前预热 PCR 仪至适宜温度，并检查其程序设置是否符合试剂盒的要求。同时，准备好干净的微量移液器及配套枪头，保证移液精度。

　　-试剂解冻与混匀

　　从 -20℃取出试剂盒后，让其缓慢升温至室温。轻轻颠倒几次使各组分充分混合均匀，但不要剧烈震荡，防止产生气泡或破坏酶活性。特别注意含有酶类的试剂，应在冰上操作以保持其稳定性。

　　-配制反应体系

　　严格按照试剂盒说明书的比例取适量的主混合物，其中已包含除模板 DNA 外的所有必要成分。然后加入经纯化的模板 DNA，加无菌水补足至总体积到规定值。使用微量移液器准确吸取各组分，每更换一种试剂最好更换一次枪头，避免交叉污染。

　　-加样与离心

　　将配制好的反应液小心地加入到 PCR 管或板中。加样完成后，轻轻混匀样品并短暂离心，使液体集中于管底，确保反应体系中各成分分布均匀。

　　-设置 PCR 程序

　　根据目标基因序列的长度和 GC 含量等因素，参照试剂盒说明书建议设置热循环仪的参数，包括变性温度、退火温度及延伸时间等。例如，一般变性温度可设为 94 - 95℃，退火温度根据引物的 Tm 值确定，通常低于引物 Tm 值 5℃左右，延伸时间则依据片段长度调整。启动 PCR 仪开始扩增反应。

　　3.酶切分析阶段

　　-准备酶切反应体系

　　PCR 扩增完成后，取一定量的扩增产物进行酶切反应。按照试剂盒提供的说明，加入适量的 SURVEYOR 酶和其他必要的缓冲液组件，构建酶切反应体系。注意控制好反应体系的体积和各成分的比例。

　　-孵育与消化

　　将配好的酶切反应体系在合适的温度下孵育一定时间，让 SURVEYOR 酶充分发挥作用，切割异源双链 DNA 错配位点。孵育过程中保持恒温环境，避免温度波动影响酶活性。

　　-终止反应

　　到达预定的孵育时间后，采取适当的方法终止酶切反应，如加热失活酶或者加入终止缓冲液。这样可以防止过度消化导致结果不准确。

　　4.Transgenomics(IDT) 突变检测试剂盒结果检测与分析

　　-选择合适的检测平台

　　该试剂盒支持多种检测平台，如标准胶电泳、荧光毛细电泳、LI - COR 等。可根据实验室现有设备条件选择合适的平台进行检测。如果使用凝胶电泳，需制备合适浓度的琼脂糖凝胶；若采用荧光检测系统，则要确保仪器的性能良好且参数设置正确。

　　-上样与检测

　　将酶切产物小心地上样到选定的检测平台上。对于凝胶电泳，要注意上样量适中，避免过载影响条带分辨率；在使用荧光检测时，要保证样品加载正确且无气泡产生。然后运行检测程序，获取数据。

　　-数据分析与解读

　　根据检测结果进行分析。观察切割片段大小能够提示突变位点的位置，切割产物的数量能够提示突变数是 1 个、2 个还是 3 个等。结合实验目的和预期结果，判断是否存在突变以及突变的类型和位置。同时，注意排除假阳性和假阴性结果的可能性，可通过重复实验或其他验证方法来确认结果的可靠性。